Phương pháp PCR có độ nhạy cao phát hiện EMS/AHPND

Phương pháp PCR có độ nhạy cao phát hiện EMS/AHPND, Nguồn: Enaca.org.

1. Tổng quan về kỹ thuật PCR phát hiện EMS/AHPND – Vào khoảng tháng 12/2014, các nhà nghiên cứu đã có được thông tin so sánh về trình tự di truyền của vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND và tiến hành các nghiên cứu phương pháp phát hiện tác nhân gây nên EMS/AHPND bằng kỹ thuật PCR. Một nhóm các nhà nghiên cứu ở Thái Lan và Đài Loan, đứng đầu là GS. T.W. Flegel và C.F. Lo đã phát triển phương pháp PCR để phát hiện vi khuẩn gây bệnh gan tụy cấp AHPND/EMS trên tôm. Các thông tin được công bố bao gồm trình tự mồi (primers) và cả qui trình chi tiết cho việc phát hiện mầm bệnh bằng kỹ thuật PCR. Đây là thông tin đầu tiên về phương pháp phát hiện vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND bằng kỹ thuật PCR. Thông tin chi tiết về kỹ thuật PCR này đã được Aquanetviet.org đăng tại đây.

– Đến khoảng tháng 6/2014, nhóm nghiên cứu của GS. Tim Flegel đã công bố một phương pháp PCR mới và cải tiến có thể phát hiện chính xác 100% mẫu tôm nhiễm EMS/AHPND. Phương pháp này dựa trên cặp mồi AP3 nên thường được gọi tắt là “AP3”. GS. Tim Flegel cho biết: “Tôi gửi cho bạn bản sao của một thông báo về một phương pháp PCR mới, hoàn toàn miễn phí để phát hiện chính xác 100% vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND. Qui trình PCR này đã được cải tiến so với qui trình PCR chúng tôi phát hành miễn phí vào tháng 12 năm 2013. Qui trình này đã được tôi công bố ở Hội nghị về tôm tại Zhanjiang, Trung Quốc vào ngày 18/06/2014”. Chi tiết về phương pháp PCR này đã được Aquanetviet.org đăng tại đây.

– Mới đây, vào tháng 2/2015, nhóm nghiên cứu của GS. Flegel tiếp tục công bố phương nested PCR (PCR hai bước) cải tiến mới gọi là “AP4” có thể phát hiện vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND có độ nhạy cao gấp 100 lần so với phương pháp cải tiến (AP3) được công bố vào tháng 6/2014. Bởi vì độ nhạy cao của phương pháp mới này nên bước nuôi tăng sinh vi khuẩn trong phương pháp sử dụng cặp mồi AP3 là không cần thiết, nó giúp rút ngắn thời gian và đơn giản hơn trong qui trình thực hiện. Tuy nhiên, phương pháp này không hẳn là một sự thay thế cho phương pháp AP3 mà nó đơn giản chỉ là có thêm một sự chọn lựa cho người dùng cần một phương pháp phát hiện bệnh EMS/AHPND có độ nhạy cao hơn.

– Phương pháp AP4 đã được thử nghiệm với 104 mẫu vi khuẩn phân lập được, kết quả thử nghiệm cho thấy kết quả giống 100% với phương pháp PCR AP3. Tuy nhiên, phương pháp này có thể phát hiện mẫu nhiễm EMS/AHPND thấp hơn 100 lần so với phương pháp AP3, tức là nó có độ nhạy cao gấp 100 lần so với phương pháp AP3.

– Điều đặc biệt là phương pháp này được công bố rộng rải và miễn phí đến tất cả mọi người để có thể áp dụng trong việc chuẩn đoán, phát hiện vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND trên tôm. Đối chứng dương dạng plasmid cho phương pháp PCR AP4 có thể liên hệ và được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu. Địa chỉ email liên hệ Dr. Kallaya Sritunyalucksana, kallaya@biotec.or.th hoặc tham gia vào nhóm AHPND Detection Google Group để cập nhật tin tức và liên hệ nhận đối chứng dương cho phản ứng PCR.

2. Chi tiết qui trình PCR phát hiện EMS/AHPND mới a) Ly trích DNA: DNA từ dạ dày, ruột hoặc mô gan tụy tôm, từ phân của tôm bố mẹ hay tôm post, hoặc từ tôm post (nguyên con) hoặc cua còng, giáp xác trong ao (vật lan truyền hoặc có thể mang mầm bệnh) hoặc bùn đáy ao,… Đối với mẫu vi khuẩn, có thể lấy trực tiếp khuẩn lạc để ly trích DNA. Hàm lượng DNA trong 25 µl phản ứng PCR khoảng 1 ng đối với DNA phân lập từ vi khuẩn hoặc khoảng 100 ng DNA phân lập từ mô tôm bệnh.

b) Thông tin về mồi cho phản ứng PCR (PCR primer):

Trình tự 2 cặp mồi cho phản ứng nested PCR. Sản phẩm khuếch đại ở bước 1 khoảng 1269 bp và 230 bp ở bước 2

c) Thành phần và điều kiện phản ứng nested PCR:

Thành phần và điều kiện phản ứng PCR bước 1

Thành phần và điều kiện phản ứng PCR bước 2

d) Điện di: Sản phẩm khuếch đại PCR được chạy điện di trên gel agarose 2% (2 g garose/100 ml dung dịch đệm), sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidium bromide, đọc kết quả dưới đèn UV.

e) Đọc kết quả: Mẫu dương tính với AHPND/EMS xuất hiện vạch có kích thước tương đương khoảng 1269 bp ở bước 1 và 230 bp ở bước 2, trong khi mẫu âm tính không có vạch nào xuất hiện trên gel sau khi điện di và soi dưới đèn UV.

(enaca.org/publications/health/disease-cards/ap4-pcr-detection-method-announcement-final%202014-02-19.pdf).